Une substance peut être parfaitement inoffensive après une exposition unique et se révéler toxique après quatre semaines d’administration répétée. C’est toute la raison d’être des études de toxicité à doses répétées : elles explorent ce que les essais de toxicité aiguë ne peuvent pas voir, à savoir l’accumulation, l’adaptation métabolique, l’atteinte progressive d’un organe cible et l’apparition d’effets qui ne se manifestent qu’au-delà d’un certain temps d’exposition.
Quatre lignes directrices de l’OCDE structurent ce domaine : les essais 407 et 408 pour la voie orale, sur 28 et 90 jours, et les essais 412 et 413 pour la voie respiratoire, sur les mêmes durées. Ce sont des études longues, coûteuses et réglementairement décisives : leur résultat détermine le NOAEL qui servira de base à l’évaluation du risque, et conditionne la classification CLP de votre substance. Choisir la mauvaise durée ou la mauvaise voie d’exposition, c’est perdre plusieurs mois et devoir recommencer.
Ce panorama vous donne les critères de choix, les paramètres réellement mesurés, et la façon dont les résultats se traduisent en obligations réglementaires.
Table des matières
Toxicité subaiguë et subchronique : de quoi parle-t-on exactement ?
La différence avec la toxicité aiguë
La toxicité aiguë mesure les effets d’une exposition unique ou de très courte durée. Elle répond à une question binaire et brutale : quelle quantité tue, ou provoque des effets sévères immédiats. Elle ne dit rien de ce qui se passe quand un travailleur respire une poussière tous les jours pendant des mois, ou quand un consommateur ingère quotidiennement un résidu à l’état de traces.
Les études à doses répétées répondent à cette seconde question. Elles ne cherchent pas une dose létale mais un seuil sans effet néfaste observé, en administrant des doses volontairement non létales pendant une durée prolongée, et en cherchant les premiers signes d’atteinte fonctionnelle ou tissulaire.
Subaiguë ou subchronique : une question de durée
La terminologie est stabilisée à l’échelle internationale. On parle de toxicité subaiguë pour une exposition répétée de l’ordre de 28 jours, et de toxicité subchronique pour une exposition de 90 jours, soit environ un dixième de la durée de vie d’un rongeur. Au-delà, on entre dans le domaine de la toxicité chronique, couverte par d’autres lignes directrices.
Cette différence de durée n’est pas cosmétique. Certains effets — induction enzymatique hépatique, atteinte tubulaire rénale, perturbation thyroïdienne, lésions dégénératives lentes — n’apparaissent tout simplement pas en 28 jours. Une étude de 28 jours qui ne détecte rien ne prouve donc pas l’innocuité d’une substance en usage prolongé : elle prouve seulement que rien n’était détectable sur cette fenêtre.
Ce que l’étude cherche réellement
Une étude à doses répétées poursuit quatre objectifs simultanés :
- Identifier les organes cibles : quel tissu encaisse en premier ? Foie, rein, thyroïde, système hématopoïétique, appareil respiratoire ?
- Établir une relation dose-réponse : l’effet augmente-t-il avec la dose, et selon quelle pente ?
- Déterminer le NOAEL et le LOAEL, qui deviendront les points de départ du calcul des valeurs limites d’exposition.
- Apprécier la réversibilité des effets observés, grâce aux groupes dits « satellites » maintenus sans traitement après la période d’exposition.
Les quatre lignes directrices en un coup d'œil
| Critère | OCDE 407 | OCDE 408 | OCDE 412 | OCDE 413 |
|---|---|---|---|---|
| Voie | Orale | Orale | Inhalation | Inhalation |
| Durée | 28 jours | 90 jours | 28 jours | 90 jours (13 semaines) |
| Type | Subaiguë | Subchronique | Subaiguë | Subchronique |
| Espèce préférentielle | Rat | Rat | Rat | Rat |
| Animaux par groupe | 5 mâles + 5 femelles | 10 mâles + 10 femelles | 5 mâles + 5 femelles | 10 mâles + 10 femelles |
| Groupes de dose | Au moins 3 niveaux + 1 groupe témoin (air et/ou véhicule pour l’inhalation) | |||
| Exposition | Quotidienne | Quotidienne | 6 h/jour, 5 j/semaine | 6 h/jour, 5 j/semaine |
| Groupe satellite | Optionnel, ≥ 14 j de récupération | Optionnel, ≥ 14 j | Optionnel, ≥ 14 j | Optionnel, ≥ 14 j |
| Version en vigueur | 2008 | 2018 | 2018 | 2018 |
Voie orale : les essais OCDE 407 et 408
OCDE 407 — toxicité orale à doses répétées, 28 jours
L’essai 407 constitue la porte d’entrée de l’évaluation à doses répétées. La substance est administrée quotidiennement par gavage, ou incorporée à l’alimentation ou à l’eau de boisson, pendant 28 jours, à au moins trois niveaux de dose plus un groupe témoin, sur des groupes de dix animaux répartis à parts égales entre mâles et femelles.
Le protocole prévoit un suivi clinique quotidien, complété en quatrième semaine par une batterie d’observations fonctionnelles : réactivité sensorielle aux stimuli, force de préhension, activité motrice. S’y ajoutent l’hématologie, la biochimie clinique, la pesée des organes, puis un examen histopathologique portant sur une liste étendue de tissus — encéphale, moelle épinière, œil, estomac, intestins, foie, reins, surrénales, rate, cœur, thymus, thyroïde, trachée, poumons, gonades et organes sexuels accessoires, vessie, ganglions lymphatiques, nerf périphérique, muscle squelettique, os et moelle osseuse.
La révision de 2008 a considérablement enrichi cette ligne directrice en y intégrant des paramètres sensibles au fonctionnement endocrinien, en particulier thyroïdien. C’est ce qui a valu à cette version le surnom d’« enhanced TG 407 » dans la littérature : au-delà de la toxicité générale, l’essai fournit désormais des signaux d’alerte sur une éventuelle activité perturbatrice endocrinienne, sans pour autant constituer à lui seul un test de perturbation endocrinienne.
OCDE 408 — toxicité orale subchronique, 90 jours
L’essai 408 reprend la même logique sur 90 jours, avec des effectifs doublés : dix mâles et dix femelles par groupe. Cette augmentation n’est pas une formalité — elle donne à l’étude la puissance statistique nécessaire pour détecter des effets de faible amplitude, ceux précisément qui échappent à une étude de 28 jours.
La version en vigueur, révisée en 2018 puis rééditée en 2025, a elle aussi intégré une série de mesures liées au système endocrinien, avec une attention particulière portée à la fonction thyroïdienne. L’essai 408 est aujourd’hui l’étude de référence pour établir un NOAEL exploitable dans une évaluation de risque, et c’est celle que les agences réglementaires attendent lorsque les tonnages ou les usages le justifient.
Nous consacrons un article complet au déroulement détaillé de cet essai : OCDE 408 : étude de toxicité orale subchronique sur 90 jours chez les rongeurs.
Pourquoi le 407 ne remplace jamais le 408
C’est l’erreur stratégique la plus fréquente, et la plus coûteuse. L’essai 407 est souvent perçu comme une version économique du 408. Il n’en est pas une.
Ses effectifs réduits et sa durée courte lui donnent une sensibilité nettement moindre. Un résultat négatif en 28 jours ne permet pas de conclure à l’absence d’effet en exposition prolongée, et les autorités ne l’accepteront pas comme substitut lorsque le 90 jours est exigé. En revanche, le 407 remplit très bien deux fonctions : il oriente le choix des doses de l’étude 90 jours, en évitant de sélectionner une dose haute qui provoquerait une mortalité excessive, et il sert de première alerte lorsqu’on ne sait rien encore d’une substance.
Enchaîner un 407 puis un 408 coûte plus cher que de commander directement un 408. Mais lancer un 408 à l’aveugle sur des doses mal calibrées, et devoir le refaire, coûte beaucoup plus cher encore.
Voie respiratoire : les essais OCDE 412 et 413
Une voie d’exposition qui obéit à ses propres règles
Les essais par inhalation ne sont pas de simples transpositions des essais oraux. L’exposition y est décrite non par une dose administrée mais par une concentration atmosphérique, et le devenir de la substance dépend étroitement de la taille des particules générées.
Les lignes directrices imposent pour les aérosols un diamètre aérodynamique médian en masse (MMAD) compris entre 1 et 3 µm, avec un écart-type géométrique situé entre 1,5 et 3,0. Cette exigence n’est pas un détail technique : elle garantit que les particules atteignent effectivement les voies respiratoires profondes du rongeur. Une atmosphère mal caractérisée invalide l’étude entière, quels que soient les résultats biologiques obtenus.
OCDE 412 — toxicité subaiguë par inhalation, 28 jours
Les animaux sont exposés six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant quatre semaines, à au moins trois concentrations plus un témoin exposé à l’air ou au véhicule. L’étude principale mobilise cinq mâles et cinq femelles par groupe.
Au-delà des paramètres classiques — observations cliniques, poids corporel, consommation alimentaire et hydrique, hématologie, biochimie, pesée des organes, histopathologie —, l’essai peut inclure un lavage broncho-alvéolaire, avec numération leucocytaire totale et différentielle, dosage des protéines totales et de la lactate déshydrogénase. Ces marqueurs détectent une inflammation pulmonaire précoce, avant même qu’une lésion histologique ne soit visible.
OCDE 413 — toxicité subchronique par inhalation, 90 jours
Même rythme d’exposition — six heures par jour, cinq jours par semaine — mais étalé sur treize semaines, avec dix mâles et dix femelles par groupe. Un groupe satellite de même effectif, exposé à la concentration la plus élevée, permet d’évaluer la réversibilité après au moins quatorze jours sans exposition.
Le protocole ajoute un examen ophtalmologique avant l’essai et à son terme. Le lavage broncho-alvéolaire est recommandé lorsque les voies respiratoires inférieures constituent le principal site de dépôt. Des investigations complémentaires peuvent être intégrées selon les enjeux : cinétique, biosurveillance, exploration fonctionnelle respiratoire, rétention des matériaux peu solubles, observations comportementales.
Du résultat à la classification : le lien avec le CLP
C’est le point que beaucoup d’industriels découvrent trop tard. Le NOAEL issu de l’étude ne reste pas un chiffre de rapport : il détermine directement si votre substance devra porter une mention de danger STOT-RE (toxicité spécifique pour organe cible, exposition répétée).
Le règlement CLP fixe des valeurs guides, exprimées pour une étude de 90 jours chez le rat. Un effet toxique significatif observé à une dose inférieure ou égale à ces seuils oriente vers une classification.
| Voie d’exposition | Catégorie 1 | Catégorie 2 |
|---|---|---|
| Orale (rat) | C ≤ 10 mg/kg p.c./jour | 10 < C ≤ 100 mg/kg p.c./jour |
| Cutanée (rat/lapin) | C ≤ 20 mg/kg p.c./jour | 20 < C ≤ 200 mg/kg p.c./jour |
| Inhalation — gaz | C ≤ 50 ppmV/6 h/jour | 50 < C ≤ 250 ppmV/6 h/jour |
| Inhalation — vapeurs | C ≤ 0,2 mg/L/6 h/jour | 0,2 < C ≤ 1,0 mg/L/6 h/jour |
| Inhalation — poussières, brouillards, fumées | C ≤ 0,02 mg/L/6 h/jour | 0,02 < C ≤ 0,2 mg/L/6 h/jour |
Une règle d’extrapolation mérite d’être retenue : pour une étude de 28 jours, ces valeurs guides sont multipliées par trois. Un effet observé à 25 mg/kg/jour dans un essai 407 se situe ainsi dans la plage de la catégorie 1 (seuil de 30 mg/kg/jour à 28 jours), là où le même effet à 25 mg/kg/jour dans un essai 408 relèverait de la catégorie 2. La durée de l’étude change donc l’issue réglementaire, à effet biologique identique.
Ces valeurs sont des repères d’orientation, non des seuils automatiques : la classification finale résulte d’un jugement d’expert intégrant la nature et la sévérité des effets, leur pertinence pour l’homme et la cohérence de l’ensemble des données.
Quand ces essais sont-ils exigés ?
Sous REACH, une logique de tonnage
Le règlement REACH articule les exigences d’information au volume mis sur le marché. En pratique, une étude de toxicité à doses répétées de 28 jours devient exigible à partir de 10 tonnes par an et par déclarant, tandis que l’étude subchronique de 90 jours est requise au franchissement du seuil de 100 tonnes par an. Au-delà de 1 000 tonnes, des études de plus longue durée peuvent être demandées.
La voie d’exposition retenue doit refléter l’exposition humaine réelle. La voie orale constitue le choix par défaut, mais si les travailleurs ou les consommateurs sont principalement exposés par voie respiratoire — poudres, aérosols, substances volatiles —, ce sont les essais 412 ou 413 qui s’imposent, et non une étude orale plus simple à organiser.
Au-delà de REACH
Ces mêmes lignes directrices structurent les dossiers de produits biocides, de produits phytopharmaceutiques, d’additifs alimentaires et d’alimentation animale, ainsi que l’évaluation biologique des dispositifs médicaux. Le secteur cosmétique fait exception : l’expérimentation animale y étant interdite pour les besoins du règlement 1223/2009, ces essais ne peuvent pas être réalisés à des fins d’évaluation de la sécurité cosmétique dans l’Union européenne.
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Comment choisir : les quatre questions à trancher
Par quelle voie l’exposition humaine se produit-elle réellement ? C’est la question première, et elle décide du couple 407/408 ou 412/413. Une réponse fondée sur la commodité expérimentale plutôt que sur le scénario d’exposition réel fragilise tout le dossier.
Quel est mon tonnage, aujourd’hui et à trois ans ? Une société qui approche du seuil de 100 tonnes a intérêt à envisager directement le 90 jours plutôt que de financer un 28 jours qu’il faudra compléter peu après.
Que sait-on déjà de la substance ? En l’absence totale de données à doses répétées, une étude de 28 jours ou une étude préliminaire de recherche de doses sécurise le choix des concentrations de l’étude principale.
La réversibilité est-elle un enjeu ? Si un effet est attendu, prévoir un groupe satellite dès la conception permet de démontrer que l’atteinte régresse à l’arrêt de l’exposition — un argument souvent déterminant dans la discussion avec l’évaluateur.
Trois points de vigilance qui font échouer un dossier
Un choix de doses mal calibré. Une dose haute qui provoque une mortalité ou une perte de poids excessive rend le groupe ininterprétable ; une dose haute trop faible ne produit aucun effet et ne permet pas de caractériser la relation dose-réponse. Dans les deux cas, l’étude ne remplit pas son office.
Une atmosphère d’exposition insuffisamment caractérisée. Pour les essais 412 et 413, la granulométrie, l’homogénéité et la stabilité de l’atmosphère doivent être documentées en continu. C’est la première chose que vérifie un évaluateur, et la première cause de rejet.
Une histopathologie non conforme aux BPL. Ces études doivent être conduites selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire pour être acceptées dans un dossier réglementaire. Une lecture histopathologique réalisée hors périmètre BPL, ou par un laboratoire non habilité, invalide plusieurs mois de travail animal.
Questions fréquentes
Peut-on remplacer une étude 90 jours par une étude 28 jours ?
Non, lorsque le 90 jours est réglementairement exigé. Le 407 et le 412 ont une puissance statistique et une fenêtre d’observation insuffisantes pour détecter les effets à évolution lente. Ils orientent le choix des doses et servent de première alerte, mais ne constituent pas un substitut recevable.
Combien de temps faut-il prévoir pour une étude de 90 jours ?
La phase d’exposition dure treize semaines, mais il faut y ajouter la phase préparatoire — caractérisation analytique, étude préliminaire de doses, mise en place de l’atmosphère pour l’inhalation — puis l’histopathologie et la rédaction du rapport BPL. Un délai global de six à douze mois est réaliste selon la complexité de la substance et la disponibilité du laboratoire.
Existe-t-il des alternatives non animales à ces essais ?
Pas de méthode validée capable de remplacer intégralement une étude à doses répétées à ce jour. Les nouvelles approches méthodologiques — modèles in vitro d’organes, modélisation toxicocinétique, approches par read-across et catégories chimiques — permettent en revanche de réduire le nombre d’études nécessaires, d’orienter la conception expérimentale et, dans certains cas, de justifier une adaptation des exigences d’information. Ces stratégies doivent être documentées avec soin pour être acceptées.
Pourquoi ces essais mesurent-ils désormais des paramètres thyroïdiens ?
Parce que les révisions successives des lignes directrices 407, 408, 412 et 413 ont intégré des mesures sensibles au fonctionnement endocrinien, la fonction thyroïdienne étant particulièrement concernée. L’objectif est de capter un signal d’alerte au sein d’une étude de toxicité générale, ce qui peut déclencher des investigations spécifiques ultérieures. Ces paramètres ne transforment pas l’essai en test de perturbation endocrinienne à part entière.
Quelle espèce est utilisée ?
Le rat est l’espèce préférentielle pour les quatre lignes directrices. Le recours à une autre espèce reste possible mais doit être scientifiquement justifié, et il complique la comparaison avec les données historiques disponibles.
Faut-il systématiquement inclure un groupe satellite ?
Il est optionnel, mais fortement recommandé dès qu’un effet est attendu à la dose haute. Une période de récupération d’au moins quatorze jours permet de distinguer une atteinte transitoire d’une lésion persistante — une distinction qui pèse lourd dans l’appréciation finale du danger.
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