La prueba OECD 408 es un método de referencia para evaluar los efectos de la exposición oral prolongada a una sustancia química. Reconocido internacionalmente, este estudio de toxicidad subcrónica es un paso esencial para evaluar el peligro y el riesgo para la salud humana.
desarrollada por la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE), se integra en los protocolos regulatorios necesarios para el registro o la evaluación de sustancias químicas, farmacéuticas, alimentarias, cosméticas y materiales. Mediante la simulación de la exposición oral repetida durante 90 días en roedores, permite caracterizar los posibles efectos nocivos a medio plazo de un compuesto y definir umbrales críticos como el Nivel Sin Efecto Adverso Observado (NOAEL). Reconocido mundialmente, este método armonizado forma parte de un enfoque gradual de la toxicología regulatoria y sirve de base para los expedientes REACH, las notificaciones a las agencias sanitarias y las evaluaciones de seguridad de los productos.
Tabla de contenido
Objetivos y principio general de la prueba OECD 408
Identificar los efectos sistémicos de la exposición repetida
El objetivo principal del ensayo OECD 408 es determinar los efectos adversos que podrían producirse tras la exposición oral diaria a una sustancia química durante un periodo de 90 días. Esta duración corresponde a una exposición subcrónica o de medio plazo, lo que permite identificar efectos que no serían observables durante una exposición de corta duración (como en estudios de 14 o 28 días).
La exposición diaria repetida permite detectar cualquier acumulación de la sustancia o sus metabolitos en el organismo. También ayuda a identificar efectos progresivos o retardados, que solo un estudio prolongado puede revelar. La prueba permite observar el impacto de la sustancia en el metabolismo, los órganos internos, los parámetros bioquímicos y la salud general de los animales.
Determinar el NOAEL y la relación dosis-respuesta
Uno de los principales resultados esperados de este estudio es la determinación del NOAEL (Nivel Sin Efecto Adverso Observado), es decir, la dosis máxima a la que no se observa ningún efecto tóxico significativo en los animales de experimentación. Este parámetro es esencial para evaluar los riesgos para la salud humana, ya que permite calcular los márgenes de seguridad y establecer los límites de exposición tolerables.
El protocolo está diseñado para establecer una relación dosis-respuesta. Tres grupos reciben dosis crecientes del compuesto en estudio, además de un grupo control que no recibe tratamiento o solo el vehículo (excipiente). El análisis comparativo entre estos grupos permite detectar los efectos relacionados con la dosis y evaluar su intensidad y frecuencia. Esta relación dosis-respuesta es un criterio fundamental para confirmar la toxicidad de una sustancia.
Diríjase a los órganos y sistemas fisiológicos afectados.
La prueba OECD 408 no se limita a una observación general del estado de salud. También tiene como objetivo identificar los órganos afectados por la toxicidad. Mediante una combinación de exámenes clínicos, biológicos, histopatológicos y conductuales, los investigadores pueden detectar los efectos específicos de la sustancia en sistemas fisiológicos precisos: hígado, riñones, sistema nervioso, sistema digestivo, glándulas endocrinas, sistema reproductor, etc.
Implementación experimental de la prueba
Especies animales utilizadas y condiciones de cría
La prueba OECD 408 se realiza principalmente en roedores, con preferencia por las ratas, cuyas respuestas fisiológicas están bien documentadas y se utilizan ampliamente como modelo predictivo para humanos. En ciertos casos, se pueden utilizar ratones, pero solo si está científicamente justificado.
Cada grupo de tratamiento debe incluir al menos 10 machos y 10 hembras para permitir el análisis de las diferencias relacionadas con el sexo. Los animales deben pertenecer a cepas estandarizadas, procedentes de colonias sanas sin enfermedades preexistentes, y deben tener una edad y un peso similares.
Las condiciones de cría deben controlarse estrictamente durante todo el estudio. La temperatura se mantiene generalmente entre 22 °C ± 3 °C, con una humedad relativa entre el 30 % y el 70 %, y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se alojan en jaulas adecuadas con lecho absorbente y tienen acceso a una dieta estandarizada libre de fitoestrógenos, así como a agua potable a libre disposición. Estas condiciones garantizan la estabilidad fisiológica y minimizan el sesgo experimental.
Métodos y procedimientos de administración
La sustancia que se va a analizar se administra por vía oral diariamente durante toda la duración del estudio, es decir, 90 días consecutivos. Se permiten tres vías de administración: sonda gástrica (introducción directa en el estómago mediante una sonda), incorporación a los alimentos o dilución en agua potable.
La elección del método de administración depende de las propiedades fisicoquímicas del compuesto, pero también del escenario de exposición realista al que podría enfrentarse un ser humano. La alimentación forzada suele preferirse para garantizar una dosificación precisa, sobre todo con formulaciones líquidas o inestables. Los alimentos o el agua potable son más adecuados para simular la exposición crónica a dosis bajas.
El volumen administrado no debe exceder la capacidad fisiológica del animal, y las soluciones deben prepararse siguiendo procedimientos rigurosos, verificando la homogeneidad y la estabilidad en cada etapa. Se presta especial atención a la trazabilidad de la sustancia: se registran sistemáticamente el número de lote, las condiciones de almacenamiento y las concentraciones preparadas y consumidas.
Selección de dosis y pruebas de límites
La determinación de los niveles de dosis se basa en los resultados de pruebas previas, como la prueba de toxicidad aguda o la prueba OECD 407 de 28 días. El objetivo es abarcar un rango de respuestas, incluyendo una dosis alta que causa efectos tóxicos, una dosis intermedia y una dosis baja que, idealmente, no induce ningún efecto medible.
Se forman tres grupos de prueba, además de un grupo de control que no recibe tratamiento o solo el vehículo (p. ej., agua, aceite, solución neutra). El protocolo también contempla la posibilidad de realizar una prueba límite a 1000 mg/kg/día en los casos en que no se prevean efectos tóxicos debido a las propiedades conocidas de la sustancia o de análogos estructurales.
La prueba límite es útil para simplificar el estudio cuando la exposición humana es baja o controlada, pero no reemplaza un protocolo completo si los resultados indican posibles efectos o si la exposición ambiental es significativa. En todos los casos, la selección de la dosis debe evitar el sufrimiento innecesario y adherirse a los principios éticos de reducción, refinamiento y reemplazo (3R) en la experimentación animal.
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Parámetros evaluados a lo largo del estudio
Monitoreo clínico diario y semanal
Los animales son observados al menos una vez al día, a una hora fija, para detectar cualquier signo de sufrimiento, deterioro de su estado general o cambios en su comportamiento. Los signos clínicos que se buscan incluyen postura anormal, trastornos locomotores, dificultades respiratorias, pérdida de reflejos, convulsiones o postración.
El peso corporal se mide una vez por semana, al igual que la ingesta de alimentos y agua. Estos datos nos permiten controlar el crecimiento y el metabolismo, y detectar cualquier disminución del apetito o deshidratación, que pueden ser indicadores tempranos de toxicidad.
Las evaluaciones funcionales semanales pueden incluir pruebas de reactividad, habilidades motoras y equilibrio. Complementan las observaciones generales al proporcionar información sobre los sistemas nerviosos central y periférico.
Análisis funcionales y biológicos
Durante el estudio se realizan varios tipos de análisis, especialmente en la fase final. Estos tienen como objetivo documentar los efectos del compuesto sobre los parámetros sanguíneos, el hígado, los riñones, los electrolitos y las funciones metabólicas.
Los análisis hematológicos incluyen la medición del hematocrito, la hemoglobina, el recuento de glóbulos rojos y blancos, el recuento diferencial de leucocitos, así como el recuento de plaquetas y el estudio de los parámetros de coagulación.
Se realizan análisis bioquímicos en suero o plasma, con un panel completo que incluye: glucosa, urea, creatinina, transaminasas hepáticas (ALT, AST), fosfatasa alcalina (ALP), colesterol total, fracciones HDL y LDL, triglicéridos, proteínas totales, albúmina, sodio, potasio, calcio y fósforo.
Con frecuencia se añade un análisis de orina para investigar la función renal. Este puede incluir mediciones de pH, densidad, la presencia de glucosa, proteínas, cetonas, sangre o leucocitos, así como un examen microscópico del sedimento.
Parámetros endocrinos y reproductivos
Desde 2018, la directriz 408 de la OCDE incluye parámetros endocrinos, en particular los relacionados con la función tiroidea. Las hormonas que se miden son la tiroxina (T4), la triyodotironina (T3) y la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Estas mediciones permiten detectar alteraciones hormonales precoces, que podrían reflejar la actividad endocrina de la sustancia analizada.
En algunos casos, sobre todo según el perfil toxicológico de la sustancia, se realizan pruebas hormonales adicionales para evaluar la función reproductiva. Estas pueden incluir análisis de testosterona, estradiol, FSH (hormona foliculoestimulante) y LH (hormona luteinizante). Dichas pruebas se llevan a cabo en momentos específicos para minimizar las variaciones debidas al ritmo circadiano, el estrés o el ciclo estral en las mujeres.
Necropsia, histopatología y análisis de órganos diana
Procedimientos de necropsia al final del estudio
Todos los animales, incluidos los del grupo de control, son sometidos a eutanasia ética siguiendo los protocolos vigentes, minimizando el estrés y el sufrimiento. Las autopsias se realizan pocas horas después de la eutanasia para preservar la integridad de los tejidos.
El procedimiento consiste en abrir las cavidades torácica y abdominal, así como en realizar un examen macroscópico de los órganos principales. Se inspeccionan visualmente los órganos para detectar anomalías evidentes: cambios en el tamaño, el color o la consistencia, la presencia de lesiones, tumores, hemorragias o necrosis.
Se realiza un registro preciso de cada órgano, acompañado de fotografías si es necesario. Las observaciones se correlacionan posteriormente con los resultados biológicos, conductuales y clínicos obtenidos durante el estudio.
Pesaje y examen macroscópico de los órganos
Ciertos órganos se extraen y pesan de forma rutinaria para evaluar cambios en su masa que puedan indicar hipertrofia, atrofia o inflamación. Este pesaje se realiza con balanzas de precisión tras la extracción, y los órganos se manipulan con cuidado para evitar cualquier pérdida de tejido.
Los órganos que se pesan incluyen el hígado, los riñones, los testículos, los epidídimos, los ovarios, el bazo, el corazón, el timo, las glándulas suprarrenales y la tiroides. Se calcula tanto el peso absoluto como el relativo (en comparación con el peso corporal) para cada individuo.
Estas mediciones son indicadores sensibles de desequilibrio fisiológico. Por ejemplo, un aumento significativo del peso del hígado puede indicar inducción enzimática o sobrecarga tóxica, mientras que una reducción del peso testicular puede reflejar una espermatogénesis alterada.
Examen histopatológico: lesiones, acumulación, efectos dosis-respuesta
Los órganos extraídos se fijan en una solución de formalina tamponada, se incluyen en parafina, se seccionan en láminas finas y se tiñen mediante técnicas estándar (generalmente hematoxilina y eosina). Posteriormente, un patólogo experimentado los examina al microscopio óptico.
El objetivo del examen histopatológico es identificar alteraciones microscópicas características: inflamación, necrosis celular, vacuolización, degeneración, fibrosis, hiperplasia o infiltración celular. Estas observaciones permiten confirmar la naturaleza de los efectos observados, precisar su localización y evaluar su gravedad.
Cuando se detectan efectos, se comparan su frecuencia e intensidad entre los diferentes grupos de tratamiento. Esto nos permite verificar si existe una relación dosis-respuesta y si los efectos son reversibles, persistentes o progresivos.
La histopatología constituye, por tanto, una valiosa fuente de datos para identificar los órganos diana de la toxicidad y orientar futuras investigaciones. Asimismo, contribuye a la interpretación de los mecanismos de acción de la sustancia analizada, especialmente cuando se observa una alteración específica de forma reproducible en varios estudios.
Procesamiento de datos y análisis estadístico
Herramientas estadísticas utilizadas
Los datos recogidos durante el estudio se someten a una serie de análisis estadísticos para detectar diferencias significativas entre los grupos expuestos a la sustancia analizada y el grupo de control. Dependiendo de la naturaleza de los datos (paramétricos o no paramétricos), se pueden aplicar diferentes pruebas.
El análisis de varianza (ANOVA) se utiliza comúnmente para comparar medias entre varios grupos cuando los datos siguen una distribución normal. En caso de diferencias significativas, las pruebas post hoc (como la de Dunnett o la de Tukey) permiten identificar los grupos implicados. Para datos no paramétricos, se prefieren las pruebas de Kruskal-Wallis o de Mann-Whitney.
Los análisis de regresión también pueden utilizarse para evaluar la linealidad de la relación dosis-efecto, mientras que la prueba de chi-cuadrado es adecuada para comparar las frecuencias de eventos discretos (como la aparición de lesiones).
La elección de los métodos depende del tipo de variable que se mide (cuantitativa, cualitativa), la distribución de los datos, el tamaño del grupo y si es necesario corregir las comparaciones múltiples. Todos los análisis deben realizarse con software validado (p. ej., SAS, R, SPSS), siguiendo protocolos preestablecidos.
Interpretación de los datos en relación con los grupos de control
Los resultados de los grupos expuestos se comparan sistemáticamente con los del grupo de control para determinar si las diferencias observadas se deben a la sustancia analizada o a la variabilidad biológica normal. Esta comparación es esencial para atribuir definitivamente un efecto a la exposición.
Se presta especial atención a las diferencias estadísticamente significativas, así como a su relevancia biológica. Un efecto puede ser estadísticamente significativo, pero mantenerse dentro de los límites de los valores históricos observados para la especie y cepa utilizadas. Por el contrario, una variación moderada pero constante puede indicar una tendencia toxicológica que debe ser monitoreada.
Para reforzar la solidez de los resultados, los datos obtenidos pueden compararse con bases de datos de referencia internas o externas que recopilan los resultados de ensayos previos realizados en las mismas condiciones. Estas bases de datos permiten evaluar la consistencia de los efectos y detectar anomalías aisladas.
Determinación del NOAEL y del LOAEL
Uno de los principales objetivos de la prueba OECD 408 es identificar el NOAEL (Nivel Sin Efecto Adverso Observado), es decir, la dosis más alta que no produce efectos tóxicos observables. Este umbral es fundamental para las evaluaciones de riesgo, ya que sirve como punto de partida para calcular la ingesta diaria admisible (IDA) o el límite de exposición ocupacional (LEO).
Cuando se observan efectos tóxicos, la dosis más baja a la que aparecen estos efectos se designa como LOAEL (Nivel Mínimo Observado de Efecto Adverso). Estos dos valores definen el nivel de seguridad toxicológica de la sustancia.
La determinación del NOAEL se basa en una síntesis integrada de todos los datos: signos clínicos, peso corporal, parámetros bioquímicos y lesiones histopatológicas. Debe tener en cuenta tanto los resultados estadísticos como su relevancia biológica y su reproducibilidad.
En casos de incertidumbre o falta de efecto, se puede proponer un valor provisional, siempre que la ausencia de efectos nocivos en las condiciones de ensayo esté claramente justificada. Este enfoque conservador suele aceptarse en el marco regulatorio, sobre todo en el caso de ensayos de dosis límite elevadas sin toxicidad observada.
La relevancia de la prueba OECD 408 dentro del marco regulatorio
Registro de sustancias químicas
La prueba OECD 408 es obligatoria en virtud de numerosos marcos regulatorios, en particular el reglamento REACH (Registro, Evaluación, Autorización y Restricción de Sustancias Químicas) aplicable en la Unión Europea. Es obligatoria para las sustancias producidas o importadas en cantidades superiores a 100 mg/kg/año, con el fin de documentar su toxicidad a medio plazo.
Los resultados de las pruebas completan el expediente toxicológico de una sustancia al proporcionar datos precisos sobre sus efectos sistémicos, órganos diana, relaciones dosis-respuesta y umbrales NOAEL y LOAEL. Esta información es esencial para determinar las clasificaciones de peligrosidad (toxicidad específica en órganos diana, toxicidad a dosis repetidas) y para evaluar los riesgos para la salud humana en función de los escenarios de exposición.
Más allá de REACH, la prueba OECD 408 también se utiliza en el contexto del reglamento CLP (Clasificación, Etiquetado y Envasado), el reglamento de biocidas (BPR), los procedimientos de evaluación de productos fitosanitarios o las solicitudes de autorización de nuevas sustancias a nivel internacional.
Aceptación por parte de los organismos reguladores
La metodología OECD 408 goza de amplio reconocimiento internacional. Es aceptada por los organismos reguladores de todos los países miembros de la OCDE, así como por otras jurisdicciones mediante acuerdos de reconocimiento mutuo de datos.
En Estados Unidos, se corresponde con el estudio OCSPP 870.3100 definido por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) como parte de las evaluaciones de seguridad química según la ley TSCA. Esta equivalencia permite a los fabricantes generar un único estudio válido en múltiples regiones del mundo, lo que reduce los costos y evita la duplicación innecesaria de pruebas en animales.
La aceptación internacional de este método se basa en su estandarización, su solidez estadística y su integración en marcos armonizados de evaluación de riesgos. Garantiza una interpretación coherente de los resultados por parte de las autoridades competentes, facilitando la tramitación de los expedientes regulatorios.
Complementariedad con nuevos enfoques (NAM)
A pesar de su importancia, la prueba OECD 408 se asocia cada vez más con métodos alternativos agrupados bajo el término NAM (Nuevas Metodologías de Enfoque). Estos enfoques incluyen ensayos in vitro, modelos in silico (QSAR), simulaciones toxicocinéticas (PBPK) y estrategias de extrapolación como la lectura cruzada.
El uso de estas herramientas permite una mejor focalización de los ensayos in vivo y una reducción en el número de animales utilizados, de acuerdo con el principio de las 3R (Reemplazar, Reducir, Refinar). Siguiendo esta lógica, el ensayo OECD 408 se integra frecuentemente en enfoques tipo IATA (Enfoques Integrados para Ensayos y Evaluación), combinando diversas fuentes de datos para evaluar un peligro o riesgo.
Por lo tanto, un modelo PBPK puede utilizarse para simular la distribución de la sustancia en el organismo, orientar la selección de la dosis e interpretar los efectos observados. De forma similar, una alerta de un modelo QSAR sobre una estructura química determinada puede justificar la realización de pruebas específicas utilizando el método OECD 408 para validar o refutar una hipótesis toxicológica.
Prueba OECD 408 realizada con YesWeLab
Una red de expertos para sus necesidades regulatorias
YesWeLab cuenta con una red de más de 200 laboratorios asociados, ubicados en toda Francia y Europa, seleccionados por su alto nivel de especialización técnica y su cumplimiento de las normas internacionales. La mayoría de estos laboratorios están acreditados según la norma ISO 17025 y reconocidos por COFRAC o sus equivalentes europeos.
Para la prueba OECD 408, YesWeLab colabora exclusivamente con laboratorios especializados en toxicología regulatoria, equipados con instalaciones adaptadas para la experimentación animal y que cumplen con los requisitos de la Directiva 2010/63/UE sobre bienestar animal. Estos socios dominan las directrices de la OCDE y las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL), lo que garantiza la obtención de datos que cumplen con los requisitos de las autoridades regulatorias.
YesWeLab ofrece un apoyo científico integral, desde la definición del protocolo hasta la interpretación de los resultados, integrando las restricciones específicas de cada sector: química, cosmética, biocidas, salud animal, etc.
Apoyo a las industrias química, cosmética y de salud animal
La realización de un ensayo OECD 408 suele integrarse en una estrategia integral de evaluación toxicológica. YesWeLab participa en todas las fases de esta estrategia, asesorando a los fabricantes en la selección de los estudios necesarios y priorizando los ensayos en función de los perfiles de riesgo, los requisitos reglamentarios y los datos existentes.
Para los fabricantes de productos químicos, el ensayo OECD 408 garantiza el cumplimiento de la normativa REACH. YesWeLab garantiza la correcta integración de los resultados en el expediente de registro, con una documentación completa compatible con plataformas regulatorias como IUCLID y REACH-IT.
En el sector cosmético, YesWeLab colabora con responsables de seguridad y toxicólogos para documentar los posibles efectos de los ingredientes utilizados durante periodos prolongados. El estudio 408 de la OCDE puede, por tanto, contribuir al informe de seguridad de los productos cosméticos, especialmente cuando se trata de nuevos principios activos o sustancias controvertidas.
En sanidad animal, el ensayo OECD 408 está integrado en los procesos de autorización de aditivos para piensos o sustancias veterinarias, prestándose especial atención a la selección de parámetros relevantes para la especie objetivo.
Una plataforma digital para centralizar tus ensayos clínicos.
Una de las fortalezas de YesWeLab reside en su plataforma digital, diseñada para facilitar la gestión de pruebas de laboratorio. Los fabricantes pueden buscar análisis, solicitar presupuestos, rastrear el envío de muestras y consultar los resultados directamente en línea.
Esta solución integral centraliza todos los servicios analíticos, incluidos los estudios de la OCDE, en un espacio seguro y personalizable. Mejora la trazabilidad de los datos, reduce los tiempos de procesamiento y garantiza una gestión óptima de los proyectos regulatorios.
Cada cliente cuenta con un contacto exclusivo, experto en análisis normativo, que le brinda apoyo durante todo el proceso: desde la elaboración de las especificaciones y la selección del laboratorio hasta el seguimiento del estudio, la revisión del informe y la interpretación de los resultados. Este enfoque personalizado da respuesta a los retos técnicos, normativos y estratégicos a los que se enfrentan las empresas innovadoras.
