Una sustancia puede ser completamente inofensiva tras una única exposición y resultar tóxica después de cuatro semanas de administración repetida. Este es precisamente el objetivo de los estudios de toxicidad por dosis repetidas: explorar lo que las pruebas de toxicidad aguda no pueden detectar, a saber, la acumulación, la adaptación metabólica, el daño progresivo a un órgano diana y la aparición de efectos que solo se manifiestan tras un cierto tiempo de exposición.
Cuatro directrices de la OCDE estructuran este ámbito: las pruebas 407 y 408 para la vía oral, con una duración de 28 y 90 días respectivamente, y las pruebas 412 y 413 para la vía inhalatoria, con la misma duración. Se trata de estudios extensos, costosos y de vital importancia regulatoria: sus resultados determinan el NOAEL, que servirá de base para la evaluación de riesgos y determinará la clasificación CLP de la sustancia. Elegir una duración o vía de exposición incorrecta implica perder varios meses y tener que empezar de nuevo.
Esta descripción general le proporciona los criterios de selección, los parámetros que se miden y cómo se traducen los resultados en obligaciones regulatorias.
Tabla de contenido
Toxicidad subaguda y subcrónica: ¿de qué estamos hablando exactamente?
La diferencia con la toxicidad aguda
La toxicidad aguda mide los efectos de una exposición única o muy breve. Responde a una pregunta simple y directa: ¿qué cantidad mata o causa efectos graves inmediatos? No dice nada sobre lo que sucede cuando un trabajador inhala polvo diariamente durante meses, o cuando un consumidor ingiere cantidades mínimas de un residuo cada día.
Los estudios de dosis repetidas responden a esta segunda pregunta. No buscan una dosis letal, sino un umbral sin efectos adversos observables, administrando deliberadamente dosis no letales durante un período prolongado y buscando los primeros signos de daño funcional o tisular.
Subagudo o subcrónico: una cuestión de duración
La terminología está estandarizada internacionalmente. subaguda a la exposición repetida durante aproximadamente 28 días, y subcrónica a la exposición durante más de 90 días, lo que equivale aproximadamente a una décima parte de la esperanza de vida de un roedor. Más allá de eso, entramos en el ámbito de la toxicidad crónica, que se rige por otras directrices.
Esta diferencia en la duración no es meramente estética. Ciertos efectos —inducción de enzimas hepáticas, daño tubular renal, trastornos tiroideos, lesiones degenerativas lentas— simplemente no aparecen en 28 días. Por lo tanto, un estudio de 28 días que no detecta nada no demuestra la seguridad de una sustancia con un uso prolongado; solo demuestra que no se detectó nada en ese lapso de tiempo.
Lo que realmente busca el estudio
Un estudio de dosis repetidas persigue cuatro objetivos simultáneos:
- Identifica los órganos diana : ¿qué tejido se ve afectado primero? ¿Hígado, riñón, tiroides, sistema hematopoyético, sistema respiratorio?
- Establecer una relación dosis-respuesta : ¿aumenta el efecto con la dosis y con qué pendiente?
- Determinar el NOAEL y el LOAEL, que servirán como puntos de partida para calcular los valores límite de exposición.
- Para evaluar la reversibilidad de los efectos observados, gracias a los denominados grupos "satélite" que se mantuvieron sin tratamiento después del período de exposición.
Las cuatro directrices de un vistazo
| Criterios | OCDE 407 | OCDE 408 | OCDE 412 | OCDE 413 |
|---|---|---|---|---|
| Forma | Oral | Oral | Inhalación | Inhalación |
| Duración | 28 días | 90 días | 28 días | 90 días (13 semanas) |
| Amable | Subagudo | Subcrónica | Subagudo | Subcrónica |
| Especies preferidas | Rata | Rata | Rata | Rata |
| Animales en grupos | 5 machos + 5 hembras | 10 machos + 10 hembras | 5 machos + 5 hembras | 10 machos + 10 hembras |
| Grupos de dosis | Al menos 3 niveles + 1 grupo de control (aire y/o vehículo para inhalación) | |||
| Exposición | A diario | A diario | 6 horas al día, 5 días a la semana | 6 horas al día, 5 días a la semana |
| Grupo satélite | Opcional, ≥ 14 días de recuperación | Opcional, ≥ 14 días | Opcional, ≥ 14 días | Opcional, ≥ 14 días |
| Versión actual | 2008 | 2018 | 2018 | 2018 |
Vía oral: juicios 407 y 408 de la OCDE
OECD 407 — Toxicidad oral por dosis repetidas, 28 días
El ensayo 407 constituye el punto de partida para la evaluación de dosis repetidas. La sustancia se administra diariamente por sonda gástrica, o se incorpora al alimento o al agua de bebida, durante 28 días, en al menos tres niveles de dosis más un grupo de control, a grupos de diez animales divididos equitativamente entre machos y hembras.
El protocolo incluye monitorización clínica diaria, complementada en la cuarta semana con una batería de observaciones funcionales: reactividad sensorial a estímulos, fuerza de agarre y actividad motora. Estas se complementan con hematología, bioquímica clínica, pesaje de órganos y, posteriormente, un examen histopatológico que abarca una extensa lista de tejidos: cerebro, médula espinal, ojo, estómago, intestinos, hígado, riñones, glándulas suprarrenales, bazo, corazón, timo, tiroides, tráquea, pulmones, gónadas y órganos sexuales accesorios, vejiga, ganglios linfáticos, nervio periférico, músculo esquelético, huesos y médula ósea.
La revisión de 2008 mejoró significativamente esta guía al incorporar parámetros sensibles a la función endocrina, en particular la función tiroidea. Esto le valió a esta versión el apodo de " TG 407 mejorada " en la literatura científica: más allá de la toxicidad general, la prueba ahora proporciona señales de alerta sobre una posible actividad disruptora endocrina, sin constituir, sin embargo, una prueba de disrupción endocrina en sí misma.
OECD 408 — toxicidad oral subcrónica, 90 días
El ensayo 408 sigue la misma lógica durante 90 días, con el doble de tamaño de muestra: diez hombres y diez mujeres por grupo. Este aumento no es una mera formalidad, sino que proporciona al estudio la potencia estadística necesaria para detectar efectos de pequeña magnitud, precisamente aquellos que pasarían desapercibidos en un estudio de 28 días.
La versión actual, revisada en 2018 y reeditada en 2025, incorpora además una serie de medidas relacionadas con el sistema endocrino, con especial atención a la función tiroidea. El ensayo 408 es ahora el estudio de referencia para establecer un NOAEL útil en una evaluación de riesgos, y es el que las agencias reguladoras esperan cuando los volúmenes o usos lo justifican.
Dedicamos un artículo completo al desarrollo detallado de este ensayo: OECD 408: Estudio de toxicidad oral subcrónica de 90 días en roedores.
Por qué la 407 nunca reemplaza a la 408
Este es el error estratégico más frecuente y costoso. La prueba 407 suele percibirse como una versión económica de la 408. No lo es.
Su pequeño tamaño muestral y su corta duración dan como resultado una sensibilidad significativamente menor. Un resultado negativo después de 28 días no permite concluir que no haya efectos por exposición prolongada, y las autoridades no lo aceptarán como sustituto cuando se requiera el estudio de 90 días. Sin embargo, la prueba 407 cumple dos funciones muy bien: orienta la elección de dosis para el estudio de 90 días, evitando la selección de una dosis alta que causaría una mortalidad excesiva, y sirve como alerta inicial cuando aún se desconocen los efectos de una sustancia.
Pedir un 407 seguido de un 408 cuesta más que pedir un 408 directamente. Pero lanzar un 408 a ciegas con dosis mal calibradas y tener que repetirlo cuesta mucho más.
Vía respiratoria: ensayos 412 y 413 de la OCDE
Un método de exhibición que sigue sus propias reglas
Las pruebas de inhalación no son meras transposiciones de las pruebas orales. La exposición se describe no mediante una dosis administrada, sino mediante una concentración atmosférica, y el destino de la sustancia depende estrechamente del tamaño de las partículas generadas.
Las directrices estipulan que los aerosoles deben tener un diámetro aerodinámico mediano de masa (MMAD) entre 1 y 3 µm, con una desviación estándar geométrica entre 1,5 y 3,0. Este requisito no es un mero detalle técnico: garantiza que las partículas alcancen eficazmente el tracto respiratorio profundo del roedor. Una atmósfera mal caracterizada invalida todo el estudio, independientemente de los resultados biológicos obtenidos.
OECD 412 — toxicidad por inhalación subaguda, 28 días
Los animales son expuestos durante seis horas al día, cinco días a la semana, durante cuatro semanas, a al menos tres concentraciones, además de un grupo de control expuesto al aire o al vehículo. El estudio principal utiliza cinco machos y cinco hembras por grupo.
Además de los parámetros estándar (observaciones clínicas, peso corporal, ingesta de alimentos y líquidos, hematología, bioquímica, pesaje de órganos e histopatología), la prueba puede incluir lavado broncoalveolarcon recuento total y diferencial de leucocitos, niveles de proteínas totales y niveles de lactato deshidrogenasa. Estos marcadores detectan la inflamación pulmonar temprana, incluso antes de que se observe una lesión histológica.
OECD 413 — toxicidad subcrónica por inhalación, 90 días
Se mantuvo el mismo esquema de exposición —seis horas al día, cinco días a la semana—, pero distribuido a lo largo de trece semanas, con diez machos y diez hembras por grupo. Un grupo satélite del mismo tamaño, expuesto a la concentración más alta, permitió evaluar la reversibilidad tras al menos catorce días sin exposición.
El protocolo incluye un examen oftalmológico antes y después del ensayo. Se recomienda el lavado broncoalveolar cuando el tracto respiratorio inferior es el principal sitio de depósito. Se pueden incorporar investigaciones adicionales según las particularidades del caso: cinética, biomonitoreo, pruebas de función pulmonar, retención de sustancias poco solubles y observaciones del comportamiento.
Del resultado a la clasificación: el vínculo con el CLP
Este es el punto que muchos fabricantes descubren demasiado tarde. El NOAEL del estudio no es solo una cifra en un informe: determina directamente si su sustancia deberá incluir una STOT-RE (toxicidad específica para órganos diana, exposición repetida).
La normativa CLP establece valores de referencia, expresados para un estudio de 90 días en ratas. Un efecto tóxico significativo observado a una dosis inferior o igual a estos umbrales conlleva una clasificación.
| Ruta de la exposición | Categoría 1 | Categoría 2 |
|---|---|---|
| Oral (rata) | C ≤ 10 mg/kg p.c./día | 10 < C ≤ 100 mg/kg p.c./día |
| Cutáneo (rata/conejo) | C ≤ 20 mg/kg p.c./día | 20 < C ≤ 200 mg/kg p.c./día |
| Inhalación — gas | C ≤ 50 ppmV/6 h/día | 50 < C ≤ 250 ppmV/6 h/día |
| Inhalación — vapores | C ≤ 0,2 mg/L/6 h/día | 0,2 < C ≤ 1,0 mg/L/6 h/día |
| Inhalación: polvo, niebla, humos | C ≤ 0,02 mg/L/6 h/día | 0,02 < C ≤ 0,2 mg/L/6 h/día |
Cabe señalar una regla de extrapolación: para un estudio de 28 días, estos valores de referencia se multiplican por tres. Por lo tanto, un efecto observado a 25 mg/kg/día en un ensayo 407 se sitúa dentro del rango de la categoría 1 (umbral de 30 mg/kg/día a los 28 días), mientras que el mismo efecto a 25 mg/kg/día en un ensayo 408 se situaría dentro de la categoría 2. En consecuencia, la duración del estudio modifica el resultado regulatorio, incluso con un efecto biológico idéntico.
Estos valores son orientativos, no umbrales automáticos: la clasificación final resulta del juicio de un experto que integra la naturaleza y la gravedad de los efectos, su relevancia para los seres humanos y la coherencia de todos los datos.
¿Cuándo son necesarias estas pruebas?
En el marco del reglamento REACH, se utiliza un enfoque basado en el tonelaje
El reglamento REACH vincula los requisitos de información con el volumen comercializado. En la práctica, un de 28 días es obligatorio para cantidades de 10 toneladas anuales o más por registrante, mientras que se requiere un subcrónico de 90 días una vez superado el umbral de 100 toneladas anuales. Para cantidades superiores a 1000 toneladas, pueden ser necesarios estudios a más largo plazo.
La vía de exposición elegida debe reflejar la exposición humana real. La vía oral es la opción predeterminada, pero si los trabajadores o consumidores están expuestos principalmente por inhalación (polvos, aerosoles, sustancias volátiles), entonces se requieren las pruebas 412 o 413, y no un estudio oral más sencillo.
Más allá de REACH
Estas mismas directrices estructuran los expedientes de productos biocidas, productos fitosanitarios, aditivos alimentarios y para piensos, así como la evaluación biológica de dispositivos médicos. El sector cosmético constituye una excepción: dado que las pruebas en animales están prohibidas en este sector en virtud del Reglamento 1223/2009, dichas pruebas no pueden realizarse dentro de la Unión Europea con fines de evaluación de la seguridad de los cosméticos.
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Cómo elegir: las cuatro preguntas para decidir
¿Cuál es la vía de exposición humana? Esta es la pregunta fundamental, y determina si se trata del par 407/408 o 412/413. Una respuesta basada en la conveniencia experimental, en lugar de en el escenario real de exposición, debilita todo el argumento.
¿Cuál es mi tonelaje hoy y dentro de tres años? Una empresa que se acerque al umbral de las 100 toneladas haría bien en considerar directamente la opción de 90 días en lugar de financiar una opción de 28 días que deberá complementarse poco después.
¿Qué sabemos ya sobre la sustancia? Ante la ausencia total de datos sobre dosis repetidas, un estudio de 28 días o un estudio preliminar de determinación de dosis garantiza la elección de las concentraciones para el estudio principal.
¿Es relevante la reversibilidad? Si se prevé un efecto, la inclusión de un grupo satélite desde la fase de diseño permite demostrar que el deterioro remite al interrumpir la exposición, un argumento que suele ser decisivo en las conversaciones con el evaluador.
Tres áreas clave de preocupación que pueden provocar el fracaso de un caso
Una selección de dosis mal calibrada. Una dosis alta que provoca mortalidad o una pérdida de peso excesiva hace que el grupo sea ininterpretable; una dosis alta que resulta demasiado baja no produce ningún efecto y no permite caracterizar la relación dosis-respuesta. En ambos casos, el estudio no cumple su propósito.
Atmósfera de exposición insuficientemente caracterizada. Para los ensayos 412 y 413, la distribución del tamaño de partícula, la homogeneidad y la estabilidad de la atmósfera deben documentarse continuamente. Esto es lo primero que verifica un evaluador y la principal causa de rechazo.
La histopatología no cumple con las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL). Estos estudios deben realizarse conforme a las BPL para ser aceptados en un expediente regulatorio. Una lectura histopatológica realizada fuera del alcance de las BPL, o por un laboratorio no autorizado, invalida varios meses de trabajo con animales.
Preguntas frecuentes
¿Se puede sustituir un estudio de 90 días por uno de 28 días?
No, no cuando el período de 90 días es obligatorio por ley. Las normas 407 y 412 carecen de suficiente potencia estadística y ventana de observación para detectar efectos de evolución lenta. Sirven de guía para la selección de la dosis y como advertencia inicial, pero no son un sustituto aceptable.
¿Cuánto tiempo debe durar un estudio de 90 días?
La fase de exposición dura trece semanas, pero debe complementarse con la fase preparatoria —caracterización analítica, estudios de dosis preliminares y preparación de la atmósfera de inhalación—, seguida de la histopatología y la elaboración del informe de Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL). Un plazo total de seis a doce meses es realista, dependiendo de la complejidad de la sustancia y la disponibilidad del laboratorio.
¿Existen alternativas a estas pruebas que no impliquen el uso de animales?
Actualmente no existe ningún método validado que pueda reemplazar por completo un estudio de dosis repetidas. Sin embargo, nuevos enfoques metodológicos —modelos de órganos in vitro, modelado toxicocinético, métodos de extrapolación y categorías químicas— permiten reducir el número de estudios necesarios, orientar el diseño experimental y, en algunos casos, justificar la adaptación de los requisitos de notificación. Estas estrategias deben documentarse cuidadosamente para su aceptación.
¿Por qué estas pruebas ahora miden parámetros tiroideos?
Debido a que las sucesivas revisiones de las directrices 407, 408, 412 y 413 han incorporado medidas sensibles a la función endocrina, siendo la función tiroidea de particular interés, el objetivo es detectar una señal de alerta temprana dentro de un estudio general de toxicidad, que posteriormente pueda dar lugar a investigaciones específicas adicionales. Sin embargo, estos parámetros no transforman el ensayo en una prueba completa de disrupción endocrina.
¿Qué especie se utiliza?
La rata es la especie preferida para las cuatro directrices. Si bien es posible utilizar otra especie, esto debe estar científicamente justificado y dificulta la comparación con los datos históricos disponibles.
¿Debería incluirse siempre un grupo satélite?
Es opcional, pero se recomienda encarecidamente siempre que se prevea algún efecto con la dosis alta. Un periodo de recuperación de al menos catorce días permite diferenciar entre un efecto transitorio y una lesión persistente, distinción que tiene un peso significativo en la evaluación final del riesgo.
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